Realaus laiko RT-PGR taikymas „Covid-19“

Kas yra realaus laiko RT – PGR?

Į PGR reakcijos sistemą pridedant fluorescencinius genus, naudojant fluorescencinio signalo kaupimą, kad būtų galima stebėti visą PGR procesą realiuoju laiku, o paskui kiek įmanoma išmatuoti nežinomą šabloną per standartinę kreivę, vadinama realaus laiko fluorescencinė kiekybinė PGR technologija, dar vadinama realaus laiko Q. -PCR.

PGR amplifikacijos principas yra tas pats, kaip ir įprastų PGR instrumentų, išskyrus tai, kad pradmenys, pridedami PGR amplifikacijos metu, yra paženklinti izotopais, fluoresceinu ir kt., O pradmenys ir fluorescenciniai zondai yra naudojami specialiai jungtis prie šablono amplifikacijai esant. tuo pačiu metu.

Padauginti rezultatai surenkami ir perduodami į kompiuterinę analizės ir apdorojimo sistemą per fluorescencinių signalų rinkimo sistemos realiojo laiko rinkimo signalą, kad būtų gautas kiekybinis realiojo laiko rezultatų išėjimas.

Realaus laiko RT – PGR yra vienas iš plačiausiai naudojamų laboratorinių metodų aptikti COVID-19 virusą. Nors daugelis šalių realaus laiko RT-PGR naudojo diagnozuodamos kitas ligas, tokias kaip Ebolos virusas ir Zikos virusas, daugeliui šalių reikia paramos pritaikant šį metodą COVID-19 virusui, taip pat didinant savo nacionalinius tyrimų pajėgumus.

Kaip realaus laiko RT – PGR veikia su COVID-19 virusu?

Mėginys imamas iš tų kūno dalių, kuriose kaupiasi COVID-19 virusas, pavyzdžiui, iš žmogaus nosies ar gerklės. Mėginys apdorojamas keliais cheminiais tirpalais, iš kurių pašalinamos tokios medžiagos kaip baltymai ir riebalai ir iš kurių išgaunamos tik mėginyje esančios RNR. Ši ekstrahuota RNR yra paties žmogaus genetinės medžiagos ir, jei yra, viruso RNR mišinys.

RNR atvirkščiai perrašoma į DNR, naudojant specifinį fermentą. Tuomet mokslininkai prideda papildomų trumpų DNR fragmentų, kurie papildo specifines perrašytos virusinės DNR dalis. Jei mėginyje yra viruso, šie fragmentai prisitvirtina prie tikslinių viruso DNR skyrių. Kai kurie iš pridėtų genetinių fragmentų yra naudojami DNR sruogoms kurti amplifikacijos metu, kiti - DNR kūrimui ir žymių etikečių pridėjimui prie sruogų, kurios vėliau naudojamos virusui aptikti.

Tada mišinys dedamas į RT – PGR aparatą. Aparatas cirkuliuoja temperatūrą, kuri kaitina ir aušina mišinį, kad būtų suaktyvintos specifinės cheminės reakcijos, sukuriančios naujas, tapačias viruso DNR tikslinių sekcijų kopijas. Ciklas pakartojamas vėl ir toliau, norint toliau kopijuoti tikslines viruso DNR dalis. Kiekvienas ciklas padvigubina ankstesnį skaičių: du egzemplioriai tampa keturiais, keturi egzemplioriai tampa aštuoniais ir pan. Standartinis realaus laiko RT – PGR nustatymas paprastai trunka 35 ciklus, o tai reiškia, kad proceso pabaigoje iš kiekvienos mėginyje esančios viruso grandinės sukuriama apie 35 milijardai naujų viruso DNR sekcijų kopijų. .

Pastačius naujas viruso DNR sekcijų kopijas, žymeklių etiketės pritvirtinamos prie DNR sruogų ir tada išsiskiria fluorescenciniai dažai, kuriuos matuoja kompiuterio kompiuteris ir realiu laiku pateikia ekrane. Kompiuteris stebi fluorescencijos kiekį mėginyje po kiekvieno ciklo. Kai viršijamas tam tikras fluorescencijos lygis, tai patvirtina, kad virusas yra. Mokslininkai taip pat stebi, kiek ciklų reikia pasiekti šį lygį, kad būtų galima įvertinti infekcijos sunkumą: kuo mažiau ciklų, tuo sunkesnė virusinė infekcija.

Kodėl verta naudoti realaus laiko RT – PGR?

Realaus laiko RT – PGR metodas yra labai jautrus ir specifiškas, todėl patikimą diagnozę galima pateikti vos per tris valandas, nors laboratorijos vidutiniškai užtrunka nuo šešių iki aštuonių valandų. Palyginti su kitais turimais virusų išskyrimo metodais, realaus laiko RT – PGR yra žymiai greitesnė ir turi mažesnį užkrėtimo ar klaidų tikimybę, nes visą procesą galima atlikti uždaroje tūbelėje. Tai ir toliau yra tiksliausias turimas metodas aptikti COVID-19 virusą.

Tačiau realaus laiko RT – PGR negali būti naudojamas aptikti buvusių infekcijų, o tai svarbu norint suprasti viruso vystymąsi ir plitimą, nes virusai organizme yra tik tam tikrą laiką. Infekcijai nustatyti, sekti ir tyrinėti būtini kiti metodai, ypač tie, kurie galėjo išsivystyti ir plisti be simptomų.